Per una migliore comprensione sia del quadro generale fisiologico sia del progressivo emergere dello stato degenerativo all’interno del quale l’ipertermia terapeutica può trovare esplicito riferimento ed utile possibilità applicativa, ci pare necessario riassumere brevemente i principali elementi di variabilità dell’omeostasi cellulare costituenti, nel loro complesso, anche la base valutativa di un ricostituito equilibrio.

 

Produzione di radicali liberi (ROS).

I “free radicals” sono atomi, raggruppamenti atomici o molecole che possiedono, a causa di fenomeni ossidoriduttivi a cui hanno partecipato, un elettrone spaiato in un orbitale, fatto che conferisce loro una elevata attività per raggiungere di nuovo la perduta stabilità costitutiva.
I mitocondri producono radicali liberi come prodotto della loro catena respiratoria. All’interno dei mitocondri o del reticolo endoteliale avviene lo stoccaggio di questi radicali che, fino ad un limite soglia ancora da individuare, partecipano attivamente ad una grande quantità di fisiologiche segnalazioni e reazioni endocellulari accompagnati dalla presenza catalizzante dello ione calcio bivalente.
Al di sopra della soglia appena accennata i ROS attivano, invece, processi oncogenici; una concentrazione ancora più elevata riesce, tuttavia, ad attivare processi necrotici anche a carico delle cellule cancerose.
Tali radicali, quindi, dal nostro punto di vista, possiedono proprietà positive o negative che sono il diretto riflesso della loro espressione quantitativa.
Le più importanti di queste proprietà possono essere così elencate, a partire da quelle positive: attivazione del fattore indotto da ipossia, HIF, che probabilmente soggiace anch’esso ad un valore soglia (al di sotto protegge le cellule normali dal rischio ipossico ed al di sopra partecipa di meccanismi, spesso paradossali, di sopravvivenza delle cellule degenerate); attivazione del sistema immunitario; regolazione della produzione di geni anticancro, signaling della cascata di alcune protein-kinasi e conseguente input apoptosico nei confronti di cellule mutagene, regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare, della attivazione linfocitaria, macrofagica e delle funzioni cellulari in generale; implicazione nei processi di angiogenesi e di produzione delle HSPs, proteine dalla valenza ristrutturante e riparatoria.
Per quanto riguarda le caratteristiche negative, le più ragguardevoli si riferiscono tutte all’induzione proliferativa di cellule cancerose, dipendente da cause generali o sostenuta dall’effetto di ritorno di più specifici processi; infatti può essere collegato ad una contemporanea sovraespressione di radicali liberi sia il riscontro di uno stato infiammatorio, ossidativo, persistente e diffuso (e dunque riconducibile ad un’alta probabilità di scorretta trascrizione genica) sia un quadro complessivo responsabile di una eccedenza di TNF (tumor necrosis factor) o di un difetto di p53 (tumor suppressor protein).
Naturalmente, la più evidente conseguenza di tale enfatizzazione patologica si traduce sempre nell’innalzamento dei processi fermentativi glicolitici, quasi completamente anaerobi, e nella produzione finale di acido lattico.
L’ipertermia terapeutica può indurre produzione di radicali liberi.

 

Produzione del fattore indotto dall’ipossia (HIF).

Con tutta probabilità, come accennato, anche per quanto riguarda l’HIF può essere elaborato il concetto di valore soglia (al di sotto del quale si rimane nel campo della normale fisiologia cellulare mentre al di sopra si entra progressivamente in quello della piena patologia) come già indicato a proposito dei radicali liberi.
Tale possibilità si intuisce da tutta una serie di lavori di ricerca dai quali si ricavano i risultati seguenti: HIF è il “master regulator of transcriptional responses” per ridurre il danno cellulare indotto da ridotta tensione di ossigeno; è un importante fattore di induzione della angiogenesi; è collegato alla produzione di citochine del sistema immunitario, all’equilibrio del pH ed a quello di ossidazione/antiossidazione, alla regolazione della cascata dei mediatori dell’infiammazione (in particolare della ciclossigenasi) e della produzione dei ROS mitocondriali; è un regolatore del metabolismo del glucosio e di quello della proteina p53. D’altra parte appare anche implicato, come se le cellule tumorali riuscissero ad utilizzare a loro vantaggio gli stessi meccanismi di sopravvivenza impiegati da quelle sane, nello sviluppo della resistenza all’apoptosi, nel consolidamento della cancerogenesi (proliferazione cellulare metastasica), nella stabilizzazione del livello anossico delle masse cancerose, nell’induzione della neoangiogenesi tumorale (i farmaci antiangiogenetici inibiscono infatti i valori elevati di HIF).
Questo specifico fattore risulta poi sempre correlabile allo sviluppo di metastasi linfatiche tanto che i relativi inibitori vengono attualmente sviluppati come antitumorali di presunta notevole attività in questo genere di evenienze.
Si è potuto rilevare, infine, che un aumento del livello di HIF provoca contemporaneamente un innalzamento di quello dei processi infiammatori, di produzione di radicali liberi intracellulari, e dei fattori di neoepitelizzazione vascolare; che in caso di abbassamento della presenza di HIF molto spesso si assiste ad una regressione tumorale e ad una riduzione della radio e chemioresistenza; che alti valori di HIF spostano l’attività di molte cascate enzimatiche endocellulari dall’apoptosi alla sopravvivenza e riproduzione di cellule mutagene.
L’ipertermia terapeutica induce un picco di HIF dopo sei ore dall’inizio del trattamento e tale picco appare del tutto parallelo a quello della concomitante produzione di tutta una serie di HSPs (heat shock proteins).

 

Produzione di proteine da stress termico (HSPs).

Le più importanti HSPs sono quelle contrassegnate dal valore numerico 27, 70, 90 e 104 (tale suffisso indicativo ne precisa il peso molecolare espresso in chilodalton).
È noto che queste “stress proteins” riescono ad istaurare un forte legame induttivo sia con il sistema immunitario sia con le più importanti cascate proteico-enzimatiche in grado di assicurare una protezione dagli agenti citolesivi o di indurre apoptosi in caso di degenerazione cellulare irreversibile.
Per questo sono stati molti i tentativi di un loro utilizzo nella terapia di varie tipologie di cancro.
Tuttavia è altrettanto noto che in caso di utilizzo di ipertermia terapeutica lo sviluppo del fenomeno di termotolleranza o termoresistenza e legato al formarsi proprio delle HSPs.
Lo sviluppo della ricerca in questo senso ha condotto da un lato al riconoscimento che le cosiddette heat shock proteins non sono generate soltanto dal calore ma anche dall’ipossia, dallo squilibrio citoplasmatico degli ioni calcio, da patologia mitocondriale, da eccesso di radicali liberi nonché da stress elettromagnetico interessante le membrane cellulari.
Dunque le HSPs sembrano in grado di intrattenere reciproche interazioni con le principali molecole attive a livello endoplasmatico prodotte in analoghe circostanze (come i ROS e l’HIF), molecole che crediamo possiedano, come sopra ricordato, un “effetto soglia” a livello dell’induzione e della proliferazione della patologia degenerativa.
I più recenti studi hanno potuto mettere in luce un analogo effetto posseduto dalle HSPs, tanto che molti dei cosiddetti aspetti paradossali osservati in precedenza possono così trovare spiegazione adeguata ed essere inquadrati in una sorta di caratteristica generale connotante tutti i mediatori dei processi endocellulari oggi conosciuti.
Il valore di soglia delle HSPs sembra tuttavia essere notevolmente più alto, tant’è che la loro attività terapeutica sembra rimanere ancora sufficientemente promettente ed il loro effetto negativo confinato a patologie di elevata malignità e velocità riproduttiva.
Come per le variabili trattate in precedenza è possibile dunque stilare un elenco di proprietà positive e negative per questa famiglia proteica, elenco anche in questo caso solo apparentemente sconcertante in quanto ormai comprensibile alla luce di una probabile attività bifasica: un eccesso di HSPs porta ad un abbassamento delle potenzialità apoptosiche e ad un innalzamento della tumorogenesi, compromette l’effetto modulatorio posseduto nei confronti delle citochine, ad un aumento della massa tumorale, ad un abbassamento del valore della caspase 3
(di elevata valenza apoptosica), ad una diffusione dei processi infiammatori, ad un innalzamento della probabilità di instaurazione di metastasi, ad una inibizione delle pathways induttive di morte cellulare guidate dalle dinamiche mitocondriali, alla progressiva inattivazione della proteina “buona” p53. In questi casi possono trovare valido utilizzo gli inibitori delle HSPs; nei casi di presenza quantitativa al di sotto della loro soglia di reattività collegata ad un riscontro in senso tumorogenico le HSPs possono invece trovare uso terapeutico, in quanto tali, in modo immediato.
Ancora una volta ci troviamo di fronte alla necessità di possedere riscontri analitici soggettivi e non protocolli impersonali finora ritenuti adeguati per tutti i pazienti.
L’ipertermia terapeutica induce la produzione di un notevole ammontare di HSPs, con un picco temporale del tutto analogo a quello di induzione sia dei ROS sia del fattore HIF.

 

Attivazione e modulazione delle principali cascate di messaggeri endocellulari.

La maggior parte dei segnali esterni orientati verso il nucleo o gli organelli citoplasmatici passa attraverso i ricettori di membrana; superata questa si attivano delle cascate (pathways) molecolari che si incaricano di portare alla specifica destinazione tali input in entrata.
È in questo modo che si veicolano le due più importanti segnalazioni che una cellula possa ricevere: riproduzione (proliferazione) ed apoptosi (programmed death).
Le tre pathways con maggiori implicazioni in questo senso, ossia le meglio conosciute per le loro dirette responsabilità in caso di progressivo coinvolgimento nelle dinamiche conducenti alla trasformazione delle cellule sane in cellule cancerose sono quelle denominate:

a) PI3K-PTEN-AKT(PKB)-mTOR (fosfatidil inositol 3kinasi-omologo della tensin fosfatasi-protein kinase B-mammalian target of rapamycin)
b) Ras-Raf-MEK-ERKs
(mitogen activated protein kinases cascade)
c) JAK-STATs-caspases
(signal trasducers and activators cascade).

La cellula sana utilizza queste tre vie proteico-enzimatiche per reagire positivamente agli stresses e solo alla fine della propria normale funzione vitale impiega le pathways sopra elencate per autoprogrammare la propria morte biofisiologica.
In caso di induzione degenerativa la cellula impiega però queste cascate a scopo di resistere agli input apoptosici ed alle eventuali terapie di contrasto messe in campo.
Ancora una volta siamo di fronte all’utilizzo di meccanismi fisiologici ai fini di una progressiva crescita tumorale.
A questo punto si possono rilevare le seguenti considerazioni: una elevata presenza di PKB può essere usata come marker di una grave forma di cancro; la prognosi diventa ancora più grave se si rileva una concomitante elevata presenza di ROS e di HSPs; l’associazione di livello elevato di ROS (e/o HIF) e PI3K indica una forte neoangiogenesi tumorale (tanto che i farmaci antiangiogenetici, come la fumagillina, sono in grado di inibire la PI3K-AKT cascade e di potenziare l’apoptosi per riequilibrio del JAK-STAT3 signaling); è dimostrato che l’ipossia (alti valori di HIF) attiva il ramo MEK-ERKs e quello PKB-mTOR in modo eccessivo e quindi verso l’induzione di sopravvivenza di cellule in difficoltà per forti stress ossidativi o per caduta del valore del pH; in queste ultime condizioni si rileva inoltre l’interazione sinergica tra molti dei diversi componenti delle tre pathways e la conseguente caduta di sensibilità della cellula nei confronti dei messaggi provenienti dal sistema immunitario; si può anche rilevare la reciprocità di sostegno tra Ras, ROS e Ca2+ signaling a finalità degenerative. Ed altro ancora.
È come dire che il superamento delle soglie sopra indicate provoca il viraggio delle funzioni cellulari dall’ambito fisiologico a quello tumorogenico e, ciò che è anche peggio, dalla possibilità di intervento terapeutico alla inutilità dello stesso per sopravvenuta resistenza.
L’ipertermia terapeutica essendo in grado di interferire con la produzione di ROS, HIF ed HSPs, appare anche in grado di relazionarsi con le tre cascate proteico-enzimatiche di cui si è adesso parlato.

 

Il ruolo fondamentale dello ione calcio bivalente.

Il ruolo endocellulare del calcio, dato soprattutto dalle proprietà di signaling possedute da questo catione bivalente, è rilevante e diversificato. I mitocondri possono a loro volta essere visti come l’hub di questo Ca2+ cellular signaling sia dal punto di vista di una situazione fisiologica che patologica.
Per quanto specificamente attiene alla seconda di queste ipotesi vale la pena di ricordare: l’ipossia è in grado di enfatizzare sia la produzione mitocondriale di ROS che il lavoro di veicolazione citoplasmatica dei canali di membrana del calcio; contemporaneamente, e ci pare del tutto logico, si rileva un aumentato valore dell’HIF e delle HSPs; a questo punto viene sostenuta la crescita tumorale e la concomitante induzione ossidativa e flogotica; in questo modo le cascades endocellulari si spostano dalla possibile apoptosi delle cellule degenerate alla sicura sopravvivenza delle medesime.
In tutto questo quadro il ruolo del calcio appare decisivo, dal momento che basta bloccarlo all’esterno della membrana per fare in modo che il ruolo chiave giocato dai ROS venga fortemente ridimensionato e l’induzione caspasica nei confronti dell’apoptosi riacquisti la perduta importanza fisiologica.
Dal momento che l’ipertermia terapeutica può anche agire (è sicuramente un fatto di superamento o meno di valori di soglia, come già detto) in sinergia con il ruolo acquisito dal calcio in caso di tumorogenesi, ci pare del tutto indispensabile conoscere le concentrazioni citoplasmatiche di quest’ultimo, se non altro per valutare, assieme ai riscontri analitici relativi alle altre variabili sopra ricordate, i tempi e le modalità operative più consone al quadro patologico che si intenda trattare con successo con un controllato apporto calorico.
Così facendo possiamo essere quasi certi che la riorganizzazione vascolare e l’aumento di flusso ematico a più elevata tensione di ossigeno assicurabili da una seduta di ipertermia si possano effettivamente realizzare senza alcun disturbo nei loro confronti e, con ogni probabilità, anche senza indesiderabili sinergie con lo stato di compromissione generalizzato già raggiunto dal paziente così posto in terapia.

 

 

Le nuove frontiere:

INDUZIONE DEL MECCANISMO APOPTOTICO
A LIVELLO MITOCONDRIALE,
CON IPERTERMIA A RADIOFREQUENZA

 

Introduzione

La divisione cellulare (proliferazione) è un processo fisiologico che ha luogo in quasi tutti i tessuti e in innumerevoli circostanze. Normalmente l'equilibrio tra proliferazione e morte cellulare programmata , che di solito avviene per apoptosi, è mantenuto regolando strettamente entrambi i processi al fine di garantire l'integrità di organi e tessuti e mantenere l’omeostasi generale.

Le mutazioni nel DNA che conducono al cancro, portano alla modifica di questi processi ordinati distruggendone i programmi regolatori. La carcinogenesi è causata dalla mutazione del materiale genetico di cellule normali, che altera l'equilibrio tra proliferazione e morte cellulare. Questo aspetto dà luogo ad una divisione cellulare incontrollata e alla formazione del tumore.

 

Quasi tutti i tumori si sviluppano a partire da una sola cellula, ma solitamente la cellula iniziale non acquisisce tutte le caratteristiche in una volta sola.
Con ogni mutazione tumorale la cellula acquisisce un leggero vantaggio evolutivo sulle cellule vicine, entrando in un processo detto di evoluzione clonale.

Ne consegue che cellule discendenti dalla cellula mutata, per effetto di ulteriori mutazioni, possano trarre un vantaggio evolutivo ancora maggiore. Lo sviluppo di un tumore è spesso iniziato da un piccolo cambiamento nel DNA, mutazione puntiforme, che porta ad una instabilità genetica della cellula. 

 

Apoptosi cellulare

Il termine apoptosi indica una forma di morte cellulare programmata. Al contrario della necrosi, che è una forma di morte cellulare risultante da un acuto stress o trauma cellulare, l'apoptosi è portata avanti in modo ordinato e regolato, ma richiede consumo di energia (ATP).


 

1. Funzioni dell'apoptosi


Nel danno cellulare

L'apoptosi può avvenire quando una cellula è danneggiata oltre le proprie capacità di riparazione, oppure infettata da un virus. Il segnale apoptotico può venire dalla cellula stessa, dal tessuto circostante o da cellule del sistema immunitario. Se la capacità apoptotica di una cellula è danneggiata la cellula stessa continuerà a dividersi senza limiti, trasformandosi in un cancro.

 

Nell’omeostasi cellulare

In un organismo adulto, il numero delle cellule contenute in un organo deve rimanere costante entro un certo margine, quindi in generale l'omeostasi è mantenuta quando la consistenza delle mitosi (proliferazione cellulare) in un tessuto, è bilanciata dalla morte di un numero equivalente di cellule.

Se questo equilibrio viene disturbato si hanno due scenari:
 

2. Il processo dell'apoptosi


Processo biochimico

Nella cellula le caspasi sono normalmente soppresse dalla proteina IAP (inibitrice dell'apoptosi). Quando una cellula riceve uno stimolo apoptotico, IAP è silenziata da SMAC (Secondo Attivatore Mitocondriale delle Caspasi) una proteina mitocondriale, che è rilasciata nel citosol.
SMAC lega IAP, e "inibisce l'inibitore" che prima evitava di far iniziare la cascata apoptotica.

Il bilanciamento tra i membri pro-apoptotici (come BAX) e anti-apoptotici (Bcl-Xl e Bcl-2) è regolato dalla formazione di omodimeri nella membrana esterna del mitocondrio. La formazione di omodimeri (di BAK o BAX) è necessaria per rendere permeabile la membrana mitocondriale esterna e rilasciare, così, l'attivatore delle caspasi. Si è notato che queste proteine (BAK e BAX), hanno domini formanti pori (che permettono di rendere permeabile la membrana), i quali favoriscono il passaggio di membrana di molecole pro-apoptotiche come il citocromo c. Una volta che è stato rilasciato il citocromo c, esso si lega ad Apaf-1 e ad ATP; in seguito si unisce ad una proteina pro-caspasi-9, creando un complesso multiproteico chiamato apoptosoma. L'apoptosoma stacca questa pro-caspasi, rendendo attiva la caspasi-9, la quale a sua volta attiva l'effettore caspasi-3 che conduce ad apoptosi cellulare.L'intero processo richiede energia e una organizzazione cellulare non troppo danneggiata, altrimenti non è in grado di portare avanti il processo dell'apoptosi.


 

3. Schema apoptotico





Considerazioni

L’intero processo apoptotico, avviene se BAX penetrando nella matrice mitocondriale induce una variazione del potenziale di transizione di permeabilità, oppure nel momento in cui alcuni aminoacidi si legano a specifici recettori di membrana.


 

Il problema nasce nel momento in cui la cellula è di fatto danneggiata, ma non riconosce il suo stato patologico.
In questo caso la cellula malata sopravvive in quanto manifesta una alterazione metabolica, che ne permette la sussistenza anche in condizioni di basse concentrazioni di ossigeno, e prolifera liberamente, acquisendo man mano un leggero vantaggio evolutivo di generazione in generazione.
L'obbiettivo deve essere quello di mandare in apoptosi in modo selettivo le cellule malate, nel modo meno invasivo e dannoso possibile, in modo che il ciclo terapeutico possa essere ripetuto anche a breve termine.
Al momento le strategie più accreditate sono due, la prima tende a ripristinare l'attività del mitocondro, la seconda interviene depolarizzando in modo artificiale la membrana dello stesso, generando la fuoriuscita di AIF.

Il metodo principe che rispetta quest'ultimo canone è indiscutibilmente l'Ipertermia a radiofrequenza.

 

Radiazioni elettromagnetiche ed Apoptosi cellulare indotta dal mitocondrio

Il mitocondrio nelle cellule neoplastiche, presenta uno stato patologico del quale è nota la causa, ovvero l’inattività della struttura è una conseguenza dell’utilizzo di una via metabolica alterativa al fine di produrre energia (effetto Warburg).
L’interazione di onde elettromagnetiche con le membrane mitocondriali, esterna ed interna induce Break Down (cortocircuito di membrana).
 

La condizione equipotenziale indotta tra le due strutture fosfolipidiche, favorisce la formazione di un poro nucleare o una lisi delle membrane mitocondriali, processi inducenti a loro volta fuoriuscita di AIF, e fattori pro-apoptotici in genere.

Una volta liberato l’AIF nel citoplasma, il processo apoptotico può procedere in modo indipendente, in quanto l’ATP necessario è presente nella cellula, anche se prodotto per via metabolica alternativa.
L’aspetto fondamentale della terapia si basa sul fatto che le cellule sane non vengono danneggiate, in quanto presentano un bilancio energetico, ed un potenziale di membrana e di organelli citoplasmatici, tale per cui l’apoptosi non avviene.

Dott. Ing. Massa Andrea   

ANGIOGENESI E OBIETTIVI VASCOLARI SULLA ASSOCIAZIONE DI ANTIANGIOGENETICI
E IPERTERMIA

 

Uno degli scopi principali dell’associazione terapeutica di Chemioterapia e Ipertermia è quello di aumentare l’attività citotossica di farmaci con molecole termo attivabili focalizzati sulle masse tumorali come applicazioni loco regionali.

La condizione indispensabile per aumentarne l’efficacia del chemioterapico è che lo stesso sia penetrato in quantità sensibile ed in modo uniformemente diffuso nelle masse tumorali in trattamento.

La mancanza di questa certezza è il grave “handicap” della Chemioterapia.

L’unico mezzo che potrebbe essere utilizzato allo scopo è quello della vascolarizzazione indotta dalla angiogenesi su tumori con dimensioni superiori a 2 o 3 mm.

In oncologia la neoangiogenesi viene demonizzata e combattuta con farmaci sempre più specializzati in quanto ritenuta il mezzo con cui le cellule tumorali in crescita si procurano i nutrienti ed eliminano le scorie.
Questo effetto è ancora tutto da dimostrare in quanto assolutamente improbabile per la disorganizzazione delle strutture del sistema vascolare noeangiogenetico.

Lo stato di ipossia tumorale che stimola la crescita neovascolare tende a produrre un groviglio di vasi collegati tra loro in modo casuale, con alcune ramificazioni non consolidate e sovradimensionate, molti vasi immaturi ed estranei e alcune zone del tumore prive del tutto di vascolarizzazione.

Il sangue fluisce veloce in alcuni vasi mentre in altri è fermo.

In un vaso, il sangue può scorrere per un po’ in un senso e poi in senso opposto, e già questo è un ostacolo alla distribuzione uniforme di eventuali farmaci.
 

Con l’applicazione dell’Ipertermia il principale effetto è quello di aumentare sensibilmente il calore nelle masse tumorali rispetto a quelle sane, in quanto caratterizzate dalla vascolarizzazione inefficiente.

L’aumento di calore all’interno della vascolarizzazione tumorale distruggerà tutti i vasi meno consolidati, immaturi, sovradimensionati a struttura caotica.
La situazione finale è quella di una vascolarizzazione “normalizzata” con la consolidazione dei vasi più efficienti.

Questa consolidazione è resa possibile per l’effetto di “Risonanza Magnetica” prodotta dalla componente elettromagnetica della ipertermia a radiofrequenze sugli “electret” del collagene epiteliale vasale inteso come “struttura di cristalli liquidi piezoelettrici”.

Il risultato finale sarà quella trasformazione di una vascolarizzazione “anormale” in “normalizzata” anche se ridotta, con strutture non elastiche ma funzionali che garantirebbero una sufficiente rete vascolare per la penetrazione e diffusione dei farmaci citotossici.

L’azione citotossica della chemioterapia nella massa tumorale sarà incrementata dall’aumento della temperatura provocata da periodici trattamenti di Ipertermia.

A fronte situazioni con grosse masse tumorali, e vascolarizzazioni fortemente compromesse, quando si ritenesse insufficiente l’associazione tra Ipertermia e Chemioterapia si potrebbe utilizzare un’associazione propedeutica tra Ipertermia e farmaci antiangiogenetici prima di una successiva di chemioterapia e Ipertermia.

 

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